ALGUMAS TÉCNICAS UTILIZADAS

TESTE DE IMUNOFLUORESCÊNCIA

     O teste de imunofluorescência é muito utilizado nos diagnósticos de laboratório para a pesquisa de anticorpos e cada vez mais com anticorpos monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espécimes clínicas. Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno.

     Teste de Imunofluorescência Direta

     O teste de imunofluorescência direta é empregado na pesquisa e na localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por lavagens e o preparado é observado em microscópio de fluorescência.

     O teste tem sido utilizado para a pesquisa de Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, estreptococos ß-hemolítico do grupo A e vários vírus, com os do herpes simples tipo 1 e 2, o citomegalovírus, os da influenza tipo A e B, os da parainfluenza 1,2 e 3, o da varicela-zoster e o adenovírus.

     Teste de Imunofluorescência Indireta

     A sensibilidade dos testes de imunofluorescência é limitada ao nível de fluorescência detectável pelo olho humano; por isso, o teste de imunofluorescência indireta tem sido empregado para amplificar o sinal e aumentar a sensibilidade. Pode ser empregado na pesquisa de antígenos ou de anticorpos. 

Para a Pesquisa de Antígenos

     Consiste na incubação da célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal conhecido ou monoclonal, levando a formação de um imunocomplexo. Após a lavagem, a preparação é incubada com um conjugado de antiimunoglobulina produzida em outra espécie de animal.

Para a Pesquisa de Anticorpos

     Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. Após lavagens, a preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno.

     TÉCNICAS COM MARCADORES RADIOATIVOS

     Radioimunoensaio

     O radioimunoensaio é um dos métodos mais sensíveis para a análise quantitativa das reações antígeno-anticorpo, permitindo medidas rápidas e precisas; mesmo em preparações não purificadas, apresenta limiar de detecção da ordem de nanogramas ou picogramas. Com limitações destacam-se o custo do teste, a vida média dos reagentes e o risco operacional.

     O radioimunoensaio pode ser utilizado para quantificar hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos e anticorpos e antígenos em doenças parasitárias. Há muitas variações, mas o princípio é o mesmo: a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não-marcado na amostra.

     Radioimunoensaio Direto

     No radioimunoensaio direto, uma quantidade fixa e limitada de anticorpo é ligada a um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa e pequena de antígeno marcado, misturada com uma amostra em teste ou com as soluções padrão que contêm concentrações conhecidas do antígeno não-marcado. Após um período de incubação, remove-se o antígeno não ligado e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

     A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

     Radioimunoensaio de competição

     No radioimunoensaio de competição, uma quantidade fixa do antígeno é imobilizada em um suporte sólido. Adiciona-se uma quantidade fixa de anticorpo marcado específico, misturada com a amostra em teste ou uma série de soluções padrão com concentrações variadas do antígeno solúvel. Após um período de incubação, o anticorpo marcado que não se ligou à fase sólida e o antígeno solúvel são removidos por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

     A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

     Radioimunoensaio de captura

     No radioimunoensaio de captura, uma quantidade fixa de anticorpo é imobilizada em um suporte. A solução teste, com quantidade desconhecida de antígeno, ou as soluções padrão, com concentrações conhecidas do antígeno são adicionadas. Após a incubação, remove-se o antígeno não-ligado e adicionam-se anticorpos marcados específicos para o antígeno, com sítio de ligação diferente do sítio do anticorpo de fase sólida. O anticorpo marcado não-ligado é removido por lavagem e faz-se a medida da radioatividade da fase sólida.

     A partir da resposta obtida, a concentração do antígeno em teste é estimada por interpolação na curva.

     TÉCNICAS IMUNOENZIMÁTICAS

     As técnicas imunoenzimáticas são baseadas na utilização de antígenos ou anticorpos marcados com enzimas e permitem a detecção, titulação e quantificação de substancias de interesse biológico.

     Imunoperoxidase

     As técnicas para localização de constituintes celulares seguem o mesmo princípio da imunofluorescência, com a diferença de que, em vez do fluorocromo, emprega-se a enzima, que tem maior capacidade de amplificação. A enzima converte o componente cromógeno (substrato+doador de hidrogênios) em produto insolúvel que precipita no sítio da reação. Esses precipitados podem ser visíveis ao microscópio eletrônico.

     Enzimaimunoensaio

     O enzimaimunoensaio é um método quantitativo em que a reação antígeno-anticorpo é monitorada por medida da atividade enzimática. Desempenha um papel muito importante no laboratório clínico, pois, além da elevada sensibilidade comparável à do radioimunoensaio, apresenta vantagens de utilizar reagentes estáveis, estar livre das exigências de trabalhar com radioisótopos e poder ser adaptado tanto a testes simples como à automação sofisticada.

     Uma característica comum entre radioimunoensaio e enzimaimunoensaio é que ambos medem, diretamente, a interação entre o antígeno e o anticorpo, não dependendo de um segundo fenômeno como precipitação, aglutinação ou fixação de complemento.

     O enzimaimunoensaio foi classificado em dois tipos: homogêneo e heterogêneo. Nos ensaios homogêneos não é necessária a separação entre os complexos antígeno-anticorpo e o antígeno e/ou  o anticorpo livres, pois a interação antígeno-anticorpo modula a atividade da enzima. Nos ensaios heterogêneos, a separação é necessária, pois a atividade da enzima não é alterada pela reação antígeno-anticorpo. Os ensaios homogêneos são mais utilizados para a detecção de haptenos e os heterogêneos para a detecção de moléculas maiores.

     ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)

     Esse teste foi desenvolvido como uma alternativa ao radioimunoensaio para a detecção de antígenos e anticorpos. O seu princípio básico é a imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida, enquanto outro reagente pode ser ligado a uma enzima, com preservação tanto da atividade enzimática como da imunológica do anticorpo.

     O teste detecta quantidades extremamente pequenas de antígenos ou anticorpos, podendo ter elevada precisão se os reagentes e os parâmetros do ensaio forem bem padronizados. Especial atenção deve ser dada a fase sólida, cujas propriedades podem variar de acordo com a composição. O grau de pureza do antígeno ou do anticorpo da fase sólida é muito importante, pois qualquer material heterólogo competirá pelo espaço na placa.

    O objetivo do ensaio é a quantificação ou verificação da presença de um antígeno ou anticorpo

     SLFIA (Substrate-Labelled Fluorescent Immunoassay)

     Pode ser utilizado para detectar reagentes de alto e baixo peso molecular. Foi desenvolvido pela Ames Company of Miles Laboratories. No ensaio, um substrato fluorogênico da ß-galactosidase é ligado covalentemente a um antígeno protéico ou hapteno. Se o anticorpo específico reage com antígeno, a enzima ß-galactosidase não cliva o substrato, por impedimento estérico. Se a amostra tiver antígeno, este se ligará ao anticorpo e o substrato ligado ao antígeno ficará livre e reagirá com a enzima para formar o produto fluorescente. O grau de fluorescência é proporcional à quantidade de antígeno na amostra.

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